Tecnología CRISPR-Cas dirigida a ARN mejorada en pez zebra

Optimización de la técnica CRISPR-Cas13d para diferentes ARNm objetivo, mostrando la extensión del fenotipo producido.

La tecnología CRISPR-Cas, conocida popularmente como «tijeras moleculares», permite editar material genético con gran facilidad y precisión, mostrando gran potencial en biotecnología y biomedicina. Aunque es más conocida por sus aplicaciones con ADN, también puede utilizarse para modificar ARN, una molécula clave en la transmisión de la información genética. Anteriormente demostramos que una variante, llamada CRISPR-Cas13d, permite modificar ARN mensajero (ARNm) de forma muy eficiente en embriones de pez zebra y otros vertebrados. Sin embargo, la tecnología CRISPR-Cas13d ha generado controversia debido a que presenta actividad colateral (efectos no deseados). En este trabajo, presentamos mejoras de la tecnología CRISPR-Cas dirigida al ARN en embriones de pez zebra, mejorando su aplicación in vivo.

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Primero, introdujimos cambios químicos específicos en las moléculas (ARN guía) que dirigen la Cas13d, aumentando el efecto observado (penetrancia fenotípica) al modificar ARNm embrionario. Además, implementamos un protocolo para evitar posibles efectos tóxicos. Seguidamente, generamos una versión de la proteína Cas13d unida a señales de localización nuclear (NLS), lo que aumenta su eficacia frente a ARN nuclear. Esto es crucial para seleccionar ARNs ubicados específicamente en el núcleo celular, como los ARN no codificantes o los microARN primarios. Finalmente, comparamos la capacidad de modelos computacionales desarrollados en cultivos celulares de mamíferos para predecir la actividad de 200 ARN guías administrados in vivo junto a proteínas Cas.

Nuestros resultados muestran que, con los ajustes adecuados, es posible modificar, de forma segura, los ARNm naturales (endógenos) en embriones de pez zebra, incluso si son muy abundantes (altamente expresados). La ausencia de actividad colateral se comprobó utilizando ARN reportero, análisis genómico y observando alteraciones fenotípicas del desarrollo embrionario. También demostramos que la actividad colateral se desencadena cuando las estrategias CRISPR-Cas13d se dirigen a ARNm extremadamente abundantes y no naturales (ectópicos), como los reporteros. Por tanto, este trabajo permite avanzar en la comprensión y mejorar de los protocolos de la tecnología CRISPR-Cas dirigida a ARN, facilitando una integración más eficaz en aplicaciones biotecnológicas y biomédicas in vivo.

Alcance de los fenotipos obtenidos mediante la eliminación de diferentes ARNm en embriones de pez cebra.

Resumen de la eficiencia de la delección de varios ARNm objetivo con diferentes proteínas Cas13d.

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Además, con el fin de ampliar el conjunto de herramientas disponibles para futuras aplicaciones médicas y biotecnológicas de herramientas CRISPR-Cas dirigida al ARN, comparamos el desempeño de varias proteínas Cas. Así, demostramos que Cas7-11 y DjCas13d pueden eliminar activamente ARN extremadamente abundantes y ectópicos (GFP) sin causar (o reduciendo en gran medida) efectos colaterales, siendo DjCas13d igual de eficiente que la Cas13d original.

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